Secretional Expression of Glutamate Decarboxylase Gene derived from Streptococcus thermophilus in Bacillus Subtilis: Its Biological Activities by GABA Production (2025)

2.1. 재료 및 시약

제한효소는 TAKARA (Shiga, Japan) 및 Elpisbio (Daejeon, Korea)로부터, T4 DNA ligase는 Thermo Fisher Scientific(Waltham, USA), EmeraldAmp^® GT PCR Master Mix는 TAKARA (Shiga, Japan)로부터, oligomer는 Genotech (Daegeon, Korea)사로부터 합성하여 사용하였다. Tryptone, yeast extract, 및 Bacto-agar와 같은 배지 성분은 Merck (Lutterworth, Germany)사로부터 구입하였고, Pyridoxa 5′-phosphate (PLP) monohydrate는 TCI (Tokyo, Japan)로부터, L-Glutamic acid monosodium(MSG)와 γ-aminobutyric acid (GABA standard)는 Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)로부터, Bradford protein assay kit (Bio-Rad, Hercules, CA, USA), membrane Immobilon-PPVDF는 Millipore (Bedford, MA, USA), Wizprep agarose gel purification kit는 Wizbiosolutions (Locohills, NM, USA), pGEM Teasy cloning kit는 Promega (Madison, Wisconsin, USA)로부터 구입하여 사용하였다. 1차 및 2차 항체는 Genscript (New Jersey, USA) 및 Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA)사로부터 구입하였으며, 나머지 시약들은 분석용 수준급을 사용하였다.

2.2. Bacterial strains, plasmid 및 medium

PCR 산물의 클로닝에 의한 plasmid 증폭 및 형질전환을 위한 기본 숙주로 E. coli XL1-Blue MRF’ (F‘, proAB, lacI^qZ△M15, thi, recA, gyrA, relA, supE, Tn10) (Stratagene, La Jolla, CA)를 사용하였으며, GAD 유전자원 확보를 위하여 Streptococcus thermophilus 균주는 일반 김치에서 분리하여 동정 후 사용하였다. 재조합 vector가 도입된 대장균 형질전환체는 37°C, 항생제 ampicillin (50 μg/mL)이 첨가된 LB(Luria-Bertani) 배지 [23]에서 배양하였고, 유전자원 확보를 위한 Streptococcus thermophilus 균주의 배양은 37°C, MRS 배지 [24]에서 배양 후 염색체 DNA를 추출하였다. PCR 산물 클로닝을 위하여 pGEM-Teasy vector (Promega, Wisconsin, USA)를 사용하였고, 고초균에서 발현 및 분비용벡터는 알칼리성 단백질분해효소 (alkaline protease) 유전자 (aprE)의 promoter (aprE-P)와 signal sequence (aprS)를 함유하는pRBAS vector [20]를 사용하였으며 분비균주로는 Bacillus subtilis LKS87 (nprR2, nprE18, aprA3, amyE) 균주 [25]를 사용하였다. 재조합벡터가 포함된 고초균 (Bacillus subtilis harboring pRBAS-GadB)은 kanamycin (50 μg/mL)을 첨가한 LB 배지를 37°C에서 전 배양 후, kanamycin (50 μg/mL)이 첨가된 PY [26] 배지에서 0.5-1% 접종 후 30°C에 배양하였다. 생물학적 활성측정 (세포 생존복구율 및 항당뇨효과)을 위한 동물세포는 insulinoma 세포인 RINm5F [22] 세포를 사용하여 분석하였다.

2.3. GAD 유전자 확보 및 재조합 발현 분비벡터 구축

유산균의 glutamate decarboxylase유전자 (gadB)를 확보하기 위하여 S. thermophilus 균주를 MRS 배지 [24]에 접종 후 37°C에서 overnight 배양한 다음 세포를 수거하여 염색체 DNA를 Johansen and Kibenich (1992) [27]의 방법에 따라 분리하였다. 즉 배양액 1.5 mL로부터 수거한 균체를 −20°C에서 1시간 이상 얼렸다가 녹인 후, TES buffer (50 mM Tris-HCl, pH 8.0, 1 mM EDTA, 6.7% sucrose)로 washing한 후, STET buffer (25% sucrose, 5% Triton X-100, 50 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl, pH 8.0, lysozyme 30 mg/ml) 374 μL에 현탁하여 15분간 37°C에서 배양하였다. 상기 배양액에 20% SDS 40 μL를 첨가하여 혼합한 후 37°C에서 30분간 반응시키고 65°C에서 30분간 반응시켰다. 상기 반응액에 TE 완충용액(10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8.0) 100 μL를 첨가한 후 페놀처리로 단백질을 제거하고, 2배의 에탄올을 첨가하여 원심분리에 의해 염색체 DNA를 분리하였다. S. thermophilus 균주의 염색체로부터 gadB 유전자를 증폭시키기 위하여 이미 보고된 S. thermophilus Y2 (GenBank DQ871217.2) nucleotide 서열을 참고하여 제한효소 부위 및 His-tag 암호화 부위가 첨가된 specific primer set [Forward primer (EcoRI) 5'GGGGAATTCAATGAGAAGCTATTCAGAGAG3', Reverse primer (SmaI) 5’ CCCCCCGGGTTAATGGTGATGGTGATGGTGATGATGGAAGCCACTGCG 3’]를 설계하여 합성한 후, 추출 분리한 염색체 DNA를 주형으로하여 PCR을 하여 얻어진 1.4 kb 크기의 단편을 pGEM-T easy vector (T-gadB)에 cloning하여 대장균에서 screening후 서열분석을 하여 유전자원으로 사용하였다. GadB의 유전자가 도입된 분비벡터를 구축하기 위해, T-gadB vector (4.4 kb)를 EcoRI과 SmaI으로 잘라 1,4 kb DNA 단편을 agarose gel로부터 확보하고, 같은 제한효소로 자른 pRBAS vector와 ligation 한 뒤, E. coli XL1-Blue MRF '로 형질전환하여 올바른 형질전환체를 선별한 다음 최종적으로 염기서열을 분석하여 이를 pRBAS-GadB(7.83 kb)로 명명하였다.

2.4. 고초균 형질전환 및 단백질 발현 분비 분석

최종적으로 확인된 pRBAS-GadB (7.83 kb) 재조합 vector는 SPMM-I (Spizizen's minimal medium)과 SPMM-II 배지를 사용하는 Sadaie and Kada [28] 방법에 의해 고초균 (B. subtilis LKS87)으로 형질전환하였고, kanamycin (50 μg/mL)이 들어간 LB 고체배지에서 형질전환체를 선별하여 GAD 단백질 발현 및 분비를 위하여 사용하였다. 얻어진 배양액을 직접적으로 또는 에탄올 침전에 의해 농축하여 2 x sample buffer(0.05 M Tris-HCl, pH 6.8, 0.1 M DTT, 2% SDS, 10% glycerol, and 0.1% bromophenol blue)에 현탁하여 100°C에서 10분 가열 후 12% SDS-PAGE (sodium-dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis) [29]에 의해 분획한 다음, Trans-Blot SD apparatus (Bio-Rad, Hercules, CA, USA)를 사용하여 gel상의 단백질들을 PVDF membrane으로 이동시키고, TBST (10mM Tris-HCl, pH 7.5, 150 mM NaCl, 0.1% Tween-20)에 skim milk를 5% 농도로 첨가하여 4°C에서 blocking 시켰다. 그 후, 1차 항체인 rabbit polyclonal anti-His-tag antibody (Genscript, 1:1,000 dilution, New Jersey, USA)로 1시간동안 반응시킨 다음, 결합되지 않은 1차 항체는 TBST 용액으로 세척하여 제거하고 2차 항체인 horseradish peroxidase-conjugated antirabbit IgG secondary antibody (1:1000, Santa Cruz Biotechnology, Dallas, Texas, USA)로 1시간동안 반응한 후, ECL^TM Western blotting detection system (Amersham Pharmacia Biotech, California, USA)을 이용하여 X-ray 필름에 감광하였다. 그 blot을 스캔하여 ChemiImager^TM (Alpha Innotech Corporation, San Leandro, USA)로 단백질의 농도를 간접적으로 비교 측정하였으며, 배양액내에 분비된 전체 단백질의 직접적인 정량은 BSA (bovine serum albumin)를 standard로 하여 Bradford protein assay kit (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) [30]를 사용하여 정량 하였다.

2.5. Paper chromatography (PC) 분석

GABA 및 MSG의 정성 분석을 위해 3M paper를 10 × 15 cm의 크기로 잘라서 사용하였고, GABA 함량과 MSG 잔존량 비교를 위한 standard로 L-Glutamic acid monosodium salt hydrate (MSG, 50 mg/ml와 GABA standard (100 mg/ml)를 사용하였다. 전개 용매는 L-butanol : acetic acid : distilled water를 4:1:2 (v/v) 의 비율로 혼합하여 사용하였다. GAD 분비 고초균을 100 ml MRS 배지에 접종 후, 30°C incubator에서 24시간 동안 배양한 후 원심분리에 의해 배양액과 pellet을 수거하고, cell pellet은 washing 후 PBS를 포함하는 lysis buffer로 파쇄 후 상층액을 취하고 L-glutamic acid monosodium salt hydrate (MSG, 150 mg/mL)와 pyridoxal 5′-phosphate (PLP) monohydrate (0.15 mM)를 넣고 pH가 4.0-5.0이 되도록 맞춰준 후, 37°C incubator (80 rpm)에서 24시간동안 교반하였다. 발효액과 standard 용액을 3 MM paper의 아래 부분에서 1 cm 정도 되는 위치에 2 μL를 점적하였고 (3 반복), 간격은 10-15 mm를 유지하였다. 점적 후 paper의 sample을 건조한 다음 전개하였고, 전개가 끝난 paper는 감압건조기에서 건조한 다음 발색 시약인 ninhydrin 용액 (0.1-0.5%)을 뿌리고, 90-100°C 건조기에서 5-10분 동안 발색 시켜 발효액과 standard의 MSG로부터 전환된 GABA spot을 확인하였다 [21].

2.6. ABTS⁺ 소거능에 의한 항산화활성 측정

ABTS⁺ [2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)는 과황산칼륨 (potassium persulfate)에 의해 전자를 손실하여 짙은 청녹색을 나타내지만, 항산화 물질의 전자공여능으로 인해 색이 옅어지는 과정을 통하여 항산화능을 측정하는 원리이다. ABTS⁺ radical 소거활성 측정 [31, 32]은 최종 농도 7 mM 2,2-azino-bis(3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid)와 2.45 mM potassium persulfate stock을 혼합하여 실온하에서 암 반응이 완료되고 흡광도가 안정될 때까지 4-16 시간 동안 반응하여 ABTS⁺를 형성시킨 후 에탄올로 희석하여 734 nm에서 흡광도 값이 0.70 ± 0.05이 되게 하였다. 희석된 시료20 μL를 반응 용액 180 μL에 넣어 1분 동안 반응한 뒤 흡광도를 측정하였다. 자유 라디칼 소거 활성(ABTS⁺)은 시료를 첨가하지 않은 대조군의 흡광도를 50%로 환원시키는데 필요한 시료의 농도인 IC₅₀ 값으로 나타냈으며 이때, 상대 활성의 비교를 위해 ascorbic acid를 대조군으로 사용하였으며, 항산화 효과는 ABTS scavenging effect = [(OD_control − OD_sample)/OD_control] × 100% 수식을 사용하여 농도에 따른 흡광도 감소를 측정하여 계산하였다.

2.7. 동물세포 배양 및 세포 생존율 측정 (MTT assay)

Insulinoma 세포주로서 RINm5F세포 [22]는 쥐 췌장 세포종에서 유래되었고 American type culture collection (ATCC, USA)으로부터 구입하여 사용하였다. 세포배지는 fetal calf serum(10%), penicillin (100 unit/mL), streptomycin (100 μg/mL)을 첨가한 RPMI-1640을 사용하였고 96 well plate 및 petri dish에서 배양하였다. 세포수를 측정하기 위하여 trypsin EDTA를 넣고 37°C에서 20분간 배양한 다음, scratch로 세포를 떼어내고 3,000 rpm에서 원심분리 한 후 상등액을 제거한 후, 신선한 배지를 넣고 현탁하여 hemocytometer (Thermo fisher scientific, Inc. Waltham, MA USA)를 이용하여 세포수를 측정하고 실험에 맞게 세포수를 조절하여 분획 후 사용하였다. 항당뇨효과는 streptozotocin (STZ)을 처리하여 type I 당뇨를 유발시키고, 세포증식 및 viability측정에 의해 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT)가 formazan으로 환원되는 것을 이용한 MTT assay를 통해 세포의 생존복구율을 측정하였다 [33,34]. 즉, 배양된 당뇨세포주 (RINm5F cell)를 96 well plate에 2 × 10⁴ cells/well의 농도로 분주하여 24시간 동안 5% CO² incubator에서 배양한 후 대조군을 제외하고 각 well에 STZ (2 mM)를 처리하고 30분간 방치하였으며, STZ가 포함된 배지를 제거해준 다음, 각 well에 대조군과 함께 시료(농도별)를 포함하는 새로운 RPMI-1640을 넣고 24시간동안 배양하였다. 배양한 세포에 1 × PBS에 녹인 MTT (5 mg/mL) 용액 50 μL를 각 well에 넣고, 5% CO² incubator에서 4시간 동안 반응시킨다. 배양 종료 후 상등액을 제거하고, 각 well마다 100 μL의 DMSO를 첨가하여 microplate reader를 사용하여 생성된 formazan crystal을 흡광도 570 nm에서 측정하였다. 세포 생존율은 시료를 처리하지 않고 무처리군 (세포만 배양)의 생존율 100%를 기준으로 세포생존율 (cell viability, %)을 상대적으로 계산하였다.

2.8. Nitric oxide (NO) 생성량 측정

Nitric oxide (NO)의 농도는 Griess Reagent System을 이용한 마이크로 분석 방법에 의해 배양액 내의 nitrite 농도를 측정하였다 [35]. RINm5F 세포를 2 × 10⁴ cells/well의 농도로 96 well plate에 분주 후 하루 동안 37°C, 5% CO₂ incubator에서 배양하고, STZ (2 mM) 처리 후 30분 동안 37°C에서 두었다가 배지를 제거하였다. 그 다음, 대조군과 함께 시료를 농도별로 처리한 후, 하루동안 37°C에서 배양한 다음 배양 상등액 100 μL를 취하여 새로운 96 well plate에 넣고 여기에 같은 양의 Griess 시약 (1% sulfanilamide/0.1% N-(1-naphtyl)-ethylenediamine dihydrochloride/2.5% H₃PO₄)을 첨가하여 10분동안 실온에서 반응 후, 540 nm에서 microplate reader를 사용하여 측정하였고, 산화질소 함량은 아질산나트륨을 표준으로 비교하여 측정하였다 [36].

2.9. 통계적 분석

결과는 통계적 유의성에 대한 사회 과학 (SPSS) 프로그램의 통계 패키지를 이용하여 분산 (ANOVA) 시험의 한 경로로 분석하였다. 모든 데이터는 평균 ±표준 편차 값으로 표현된다. 모든 분석에서 0.05보다 작은 P값은 통계적으로 유의한 것으로 간주하였다.